近日，华南农业大学农学院、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室、岭南现代农业科学与技术广东省实验室刘耀光院士/祝钦泷研究员团队在国际著名学术期刊《Plant Biotechnology Journal》在线发表了题为“PhieDBEs: a DBD-containing, PAM-flexible, high-efficiency dual base editor toolbox with wide targeting scope for use in plants”的研究论文。该研究在前期开发的单碱基编辑器PhieCBEs和PhieABEs基础上，利用高活性胞嘧啶脱氨酶（evoFERNY）和腺嘌呤脱氨酶（Tad8e）、单链DNA结合结构域（DBD）与广靶向的SpCas9缺刻酶变体SpGn，成功开发了一套广靶向的植物高效双碱基编辑器PhieDBEs（plant high-efficiency dual base editors），进一步完善了植物基因编辑工具箱。此外，通过不同组合方式将功能元件DBD融合在双碱基编辑器不同位置，探究了其最佳融合位置和拷贝数，为开发多元件多重功能的基因编辑工具提供了重要参考。
与单碱基编辑器相比，双碱基编辑器的优势在于能够在同一密码子内产生两种碱基替换从而实现额外的 9 种氨基酸突变，并产生更丰富的突变组合。但由于其仍然存在 SpCas9n 靶向范围窄（识别 NGG-PAM）、双碱基同步发生编辑的效率较低等问题，限制了双碱基编辑器（DBEs）在植物中的广泛应用。
基于高活性的SpCas9n变体SpGn（NG-PAM），该研究利用高活性胞苷脱氨酶evoFERNY和腺苷脱氨酶TadA8e，以及人源RAD51 DBD的不同融合方式，构建了由9个编辑器组成的一系列DBE-SpGn载体（图1）。通过DBE-SpGn一系列载体对水稻中48个靶点编辑效率的系统性检测，结果发现在 SpGn 的 N 端融合了单拷贝 DBD 的 C-A-D-SpGn 平均编辑效率最高为41.9%，比不含DBD的C-A-SpGn (33.7%)显著提高，表明当两种脱氨酶和单拷贝DBD 均位于 SpGn 的 N 端时能更有效地实现双碱基编辑。而融合了双拷贝DBD的C-D-SpGn-D-A 和 A-D-SpGn-D-C的平均编辑效率仅2.3%和10.8%，这表明多拷贝的DBD并不能提高编辑效率，还会因功能元件较多而导致的空间位阻抑制了DBEs 发挥有效功能。此外，将脱氨酶融合在C端则使其对应产生的碱基脱氨频率大幅度降低，而融合在复合体N端时更有利于其发挥功能，说明脱氨酶也具有明显的N端位置优势。
图1. 双碱基编辑器DBE-SpGn的结构与编辑特征。（A）DBE-SpGn的载体结构图；（B）C-A-D-SpGn的工作示意图；（C）DBE-SpGn 分别在 12 个测试的水稻内源靶点的编辑效率；（D）各个载体在靶点范围内所产生的不同的碱基编辑产物。
从DBE-SpGn 载体中筛选出能够高效产生 A-to-G＆C-to-T 同步替换的一组双碱基编辑器（C-A-SpGn，C-A-D-SpGn和A-C-D-SpGn），将其命名为 PhieDBEs。其中C-A-D-SpGn在靶点V2TS6-TGW6上编辑效率最高可达95.2%，并且A-to-G＆C-to-T同时替换的概率最高达81.0%。此外，PhieDBEs的 C-to-T 和 A-to-G 编辑窗口趋于一致，主要口集中在 M5-M9（M=A/C），C-A-SpGn 和 C-A-D-SpGn 在主要窗口外的 A3处也显示较高的编辑活性（图2）。与此前大部分研究报道的碱基编辑器相较而言，PhieDBEs编辑窗口变窄，更有利于进行精准编辑。最后，该研究对PhieDBEs的多种编辑特性进行了分析，结果表明能够高效靶向 NG PAM，并且在靶点内对 A 或 C 的编辑都不存在明显的序列背景偏好性，使用一个载体能够实现多个靶点同时产生多种类型的碱基替换等优点。
图2. PhieDBEs在靶位点产生有效的双碱基转换。（A）的编辑活性窗口；（B）DBE-SpGn所产生的突变类型比例；（C）DBE-SpGn在四种NGN-PAM靶位点的编辑效率。
该研究通过两个高活性脱氨酶和广靶向的SpGn变体，以及 RAD51 DBD 的组合，开发了一套植物高效广靶向的双碱基编辑系统 PhieDBEs，揭示了功能元件 DBD 的最优融合条件及其对邻近脱氨酶的影响，以及脱氨酶自身具有的位置效应，为开发多元件多重功能的碱基编辑器提供了重要参考。PhieDBEs表现出比目前已报道的植物双碱基编辑器更优异的编辑活性和较窄的编辑窗口，有利于实现更加准确的核苷酸替换和特定的氨基酸转变，这将为植物功能突变体的筛选提供更多可选择工具，进一步完善了植物高效碱基编辑系统工具箱。
博士生郑芷晔和刘涛利，博士后柴楠为该论文的共同第一作者，祝钦泷研究员与刘耀光院士为论文的共同通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、广东省“十四五”农业科技创新十大重点项目、岭南现代农业实验室项目、广东省基础与应用基础研究重大项目和广东省大学生科技创新战略专项资金（“攀登计划”专项资金）的资助。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14438
